褐藻多糖GS201促进嗅神经鞘细胞体外增殖作用的研究
【摘要】 目的 研究褐藻多糖GS201促进神经细胞修复的机制和体外培养作用的最适浓度。方法 将成年兔嗅球，用植块法分离纯化嗅神经鞘细胞(Olfactory ensheathing cells，OECs)，将纯化后的OECs培养24h后分成4组:褐藻多糖GS201组(按用药浓度分3组:0.01mg/L组为B组，0.1mg/L为C组，1mg/L为D组和正常组为A组)相差显微镜观察每日计数测定OECs的增殖曲线，24h、72h后用流式细胞仪测定S期的比例。结果 0.01mg/L浓度对OECs的增殖作用不明显，0.1mg/L和1mg/L浓度组在24h和72h后处于S期的OECs明显增多。10d后药物组细胞计数明显高于对照组。其中0.1mg/L和1mg/L组和对照组的倍增时间分别为6.2d、4.9d和8.4d。两者相比，差异有非常显著性(t=16.90、17.14，P<0.01)。结论 褐藻多糖GS201能显著地促进OECs的增殖从而促进神经损伤的修复。
关键词 嗅神经鞘细胞 褐藻多糖GS201 神经修复
, 百拇医药
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)06-0810-02
Promotion of proliferation of olfactory ensheathing
cells in vitro by GS201
Bu Lin，Cui Xiumei，Kang Yi
Department of Orthopedics，Affiliated Hosiptal Guangdong Medical College，Zhanjiang524001.
【Abstract】 Objective To study the mechanism of GS201in nerve cells，regeneration and the opitmal concenˉtration in vitro.Methods The purified olfactory ensheathing cells(OECs)from adult rabbit were prepared under exˉplanting procedure into4group:the GS201group(3groups according to different concentration)and control group.The OECs was counted every day with phase contrast microscope and proliferation curve drawn.After24and72hours the ratio of OECs in S phase was determined by flow cytometry.Results When GS201was0.01mg/L，no obvious effect promotion of proliferation of OECs was found.Pronounced increase of OECs in S phaseoccurred after24hours in0.1mg/L and1mg/L GS201group.After10days in vitro.The doubling time of the0.1mg/L and1mg/L GS201group and control group were6.2，4.9and8.4days，respectively.There was statistical significant difference.Conclusion These finding indicated the GS201could markedly promote OECs proliferation and thereby facilitate repair of nerve cells injury.
, 百拇医药
Key words olfactory ensheathing cells GS201 nerve repair
海洋多糖对神经细胞有营养作用，能够促进神经营养因子的表达，这些作用和神经营养因子的作用相似 [1，2]，但其神经修复的机制不清楚。嗅神经鞘细胞(olfactory enˉsheathing cells’OECs)在脊髓损伤治疗中的研究较多 [3] ，为了解神经损伤后褐藻GS201是否可以产生使OECs增殖存活的物质，而设计了本实验研究。
1 材料与方法
1.1 嗅神经鞘细胞的体外培养 用成年新西兰兔2只，静脉麻醉，断头，取出嗅球，在解剖显微镜下仔细剥离神经外膜及其周围粘连组织，将切成0.5mm 3 的小碎块种植于培养皿中，加入适量培养液(80%的DMEM，20%的小牛血清)，待OECs长满培养皿后进行传代。在种植的2周末作活细胞观察，OECs比例90%以上，如果在培养过程中发现成纤维细胞生长，可以用阿糖胞苷处理。在培养过程中用S-100蛋白抗体行免疫组织化学染色鉴定。
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1.2 嗅神经鞘细胞增殖分析 取上述纯化的OECs接种于40个培养皿中进行传代，分成4组:A组为对照组，B组为0.01mg/L组，C组为0.1mg/L组，D组为1mg/L组。每组培养10个培养皿，每培养皿接种细胞1×60 6个。3个药物组分别用含0.01mg/L、0.1mg/L和1mg/L的褐藻GS201复合液培养液换液，对照组用一般复合培养液(80%的DMEM，20%的小牛血清)换液。每2天换培养液一次，共作用10天。在相差显微镜下行形态学观察，每2天在每个培养皿中随机选取3个视野进行OECs计数，并做好标记以后计数时每视野的标记均位于指针的尖端。并用4%的甲醛将细胞固定后行S-100免疫染色，并记数染色阳性的细胞。用上述两种方法来判定OECs增殖数量及其纯化度。各组比较时，以增殖指数(proliferation index，PI=各次观察细胞数/初次观察细胞数)为指标。结果用两样本均数比较t检验进行统计分析。
1.3 亚倍体细胞比例的测定 将纯化好的1.5mlOECs的细胞悬液(每ml约1×10 6 的细胞数)，接种于3.5cm的培养器中，培养24h后分为对照组和3组不同浓度的药物组(GS201含量为0.01、0.1、1mg/L)培养72h后吸取培养液，用D-Hank液洗涤一次，用0.25%胰酶、0.02EDTA消化瓶中细胞，待细胞脱离瓶底后滴入血清终止消化，吹打成单细胞悬液，并将悬液移入10ml离心管，以1500r/min离心5min，弃上清液加入无水乙醇固定细胞。上流式细胞仪(FACS caliiburi、美国BD公司)前取样本细胞悬液，1500r/min离心5min，弃上清液，加入1%Tritonx-100静置5min，再次离心弃上清液，加入1%RNA酶，37℃水浴、振荡10min、1500r/min离心5min，弃上清液，加入0.5%PI，避光染色30min后上机检测(波长480mm)G 0 /G 1 期之前的亚二倍体峰。
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2 结果
活细胞数:对照组OECs的倍增时间为8.4d，0.1mg/L 组细胞倍增时间为6.2d，1mg/L组细胞倍增时间为4.9d。每次细胞计数的结果见表1。表1中数据30个视野各次细胞计数/初次细胞计数的均数±标准误，细胞计数统计分析，两组间均数比较的t检验结果:A vs C，A vs D，P<0.01。A vs B，P>0.05，C vs D:(第2、4d)，P>0.05;(第6、8、10d)，P>0.01(见表2)。
表1 褐藻多糖GS对OECs增殖的影响 (略 )
表2 不同浓度褐藻GS201培养OECs24h、72h后S期百分率(略 )
3 讨论
海洋特殊环境赋予海洋多糖结构的特殊性和功能特异性。褐藻多糖GS201参与各重大生命过程，在胚胎生长发育、细胞生长分化，特别是神经细胞生长、发育和分化起着重要作用。
, 百拇医药
流式细胞技术在细胞生物研究中最重要的应用是生物细胞增殖周期的定量分析。通过对细胞DNA进行特异性的荧光标记，常用的荧光染色有PI、EB、AO等，经FCM测量、获得DNA含量分布的组方图，采用DNA细胞周期分析程序、快速计算生长期分布百分比，用增殖数S+G 2 M期细胞或S期的百分比、以表示细胞群体的增殖状态和DNA的合成速度。大量的文献报道已证实DNA细胞增殖周期的分析对反映细胞群体的增殖活性具有重要意义 [4，5] 。
本实验结果显示，0.1mg/L和1mg/L浓度GS201在作用24h时就能够促进OECs增殖，这一作用可一直延续10d。第10d将样本置于相差显微镜观察上，OECs数量明显高于未用GS201的对照组。流式细胞仪测定结果显示药物浓度为0.1mg/L和1mg/L的GS201、OECs增殖活力有明显增高趋势，这说明GS201对体外培养的OECs有促进增殖作用。流式细胞仪测得结果和OECs计数所得的生长曲线相对应。浓度低的(0.01mg/L)GS201组则没有促进OECs增殖作用，在体外培养24h和72h时，流式细胞分析S期细胞的百分比与对照组相比，差异没有显著意义(P>0.05)，这一结果表明浓度过低时其促进作用不明显。
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本研究结果表明:一定浓度的GS201，在新西兰兔嗅球鞘细胞的体外培养中可明显地促进OECs的增殖从而达到促进神经细胞损伤的修复效果[6] 。主要作用可能通过调节酪氨酸激酶、影响细胞因子产生发挥其作用。GS201作为一种海洋多糖类药物其神经细胞营养作用是通过何种途径介导有待进一步探讨。
参考文献
1 Rainer probstmeier，christin C.Chondriotin sulfates expressed on oligoˉdendrocyte-derived Tenascin-R are involved in neural cell recongniˉtion.Functional implications during CNS development and regeneration.J Neurosci Res，2000，60:21.
2 Kitani K，Aoba A，Goto S.The neurobiology of Alzheimer’s disease.Ann Ny Sci Acad，1996，777:1.
, 百拇医药
3 Ramon-Cueto A，Cordeo MI，Santos-Benito FF，et al.Functional reˉcovery ofparaplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia.Neuron，2000，25:425-435.
4 Syriod D，Zorick T，Engels C，et al.A role for insulin-like growth facˉtor-1in the regulation of Schwann cell survival.J Reconstr Microsurg，1999，15:61-65.
5 Yan Q.in vivo neurotrophic effects GONF on neonatal and adult facial motorneurons.Nature，1995，373:341-344.
6 Junghans U.Purification of a meningeal cell-derived chondroitin Sulˉphateproteoglycan with neurotrophic activity fou brain neurons and its iˉdentification as giglycan.Eur J Neurosci，1995，7(11):2341.
(编辑 元红), 百拇医药(布林)
关键词 嗅神经鞘细胞 褐藻多糖GS201 神经修复
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)06-0810-02
Promotion of proliferation of olfactory ensheathing
cells in vitro by GS201
Bu Lin，Cui Xiumei，Kang Yi
Department of Orthopedics，Affiliated Hosiptal Guangdong Medical College，Zhanjiang524001.
【Abstract】 Objective To study the mechanism of GS201in nerve cells，regeneration and the opitmal concenˉtration in vitro.Methods The purified olfactory ensheathing cells(OECs)from adult rabbit were prepared under exˉplanting procedure into4group:the GS201group(3groups according to different concentration)and control group.The OECs was counted every day with phase contrast microscope and proliferation curve drawn.After24and72hours the ratio of OECs in S phase was determined by flow cytometry.Results When GS201was0.01mg/L，no obvious effect promotion of proliferation of OECs was found.Pronounced increase of OECs in S phaseoccurred after24hours in0.1mg/L and1mg/L GS201group.After10days in vitro.The doubling time of the0.1mg/L and1mg/L GS201group and control group were6.2，4.9and8.4days，respectively.There was statistical significant difference.Conclusion These finding indicated the GS201could markedly promote OECs proliferation and thereby facilitate repair of nerve cells injury.
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Key words olfactory ensheathing cells GS201 nerve repair
海洋多糖对神经细胞有营养作用，能够促进神经营养因子的表达，这些作用和神经营养因子的作用相似 [1，2]，但其神经修复的机制不清楚。嗅神经鞘细胞(olfactory enˉsheathing cells’OECs)在脊髓损伤治疗中的研究较多 [3] ，为了解神经损伤后褐藻GS201是否可以产生使OECs增殖存活的物质，而设计了本实验研究。
1 材料与方法
1.1 嗅神经鞘细胞的体外培养 用成年新西兰兔2只，静脉麻醉，断头，取出嗅球，在解剖显微镜下仔细剥离神经外膜及其周围粘连组织，将切成0.5mm 3 的小碎块种植于培养皿中，加入适量培养液(80%的DMEM，20%的小牛血清)，待OECs长满培养皿后进行传代。在种植的2周末作活细胞观察，OECs比例90%以上，如果在培养过程中发现成纤维细胞生长，可以用阿糖胞苷处理。在培养过程中用S-100蛋白抗体行免疫组织化学染色鉴定。
, http://www.100md.com
1.2 嗅神经鞘细胞增殖分析 取上述纯化的OECs接种于40个培养皿中进行传代，分成4组:A组为对照组，B组为0.01mg/L组，C组为0.1mg/L组，D组为1mg/L组。每组培养10个培养皿，每培养皿接种细胞1×60 6个。3个药物组分别用含0.01mg/L、0.1mg/L和1mg/L的褐藻GS201复合液培养液换液，对照组用一般复合培养液(80%的DMEM，20%的小牛血清)换液。每2天换培养液一次，共作用10天。在相差显微镜下行形态学观察，每2天在每个培养皿中随机选取3个视野进行OECs计数，并做好标记以后计数时每视野的标记均位于指针的尖端。并用4%的甲醛将细胞固定后行S-100免疫染色，并记数染色阳性的细胞。用上述两种方法来判定OECs增殖数量及其纯化度。各组比较时，以增殖指数(proliferation index，PI=各次观察细胞数/初次观察细胞数)为指标。结果用两样本均数比较t检验进行统计分析。
1.3 亚倍体细胞比例的测定 将纯化好的1.5mlOECs的细胞悬液(每ml约1×10 6 的细胞数)，接种于3.5cm的培养器中，培养24h后分为对照组和3组不同浓度的药物组(GS201含量为0.01、0.1、1mg/L)培养72h后吸取培养液，用D-Hank液洗涤一次，用0.25%胰酶、0.02EDTA消化瓶中细胞，待细胞脱离瓶底后滴入血清终止消化，吹打成单细胞悬液，并将悬液移入10ml离心管，以1500r/min离心5min，弃上清液加入无水乙醇固定细胞。上流式细胞仪(FACS caliiburi、美国BD公司)前取样本细胞悬液，1500r/min离心5min，弃上清液，加入1%Tritonx-100静置5min，再次离心弃上清液，加入1%RNA酶，37℃水浴、振荡10min、1500r/min离心5min，弃上清液，加入0.5%PI，避光染色30min后上机检测(波长480mm)G 0 /G 1 期之前的亚二倍体峰。
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2 结果
活细胞数:对照组OECs的倍增时间为8.4d，0.1mg/L 组细胞倍增时间为6.2d，1mg/L组细胞倍增时间为4.9d。每次细胞计数的结果见表1。表1中数据30个视野各次细胞计数/初次细胞计数的均数±标准误，细胞计数统计分析，两组间均数比较的t检验结果:A vs C，A vs D，P<0.01。A vs B，P>0.05，C vs D:(第2、4d)，P>0.05;(第6、8、10d)，P>0.01(见表2)。
表1 褐藻多糖GS对OECs增殖的影响 (略 )
表2 不同浓度褐藻GS201培养OECs24h、72h后S期百分率(略 )
3 讨论
海洋特殊环境赋予海洋多糖结构的特殊性和功能特异性。褐藻多糖GS201参与各重大生命过程，在胚胎生长发育、细胞生长分化，特别是神经细胞生长、发育和分化起着重要作用。
, 百拇医药
流式细胞技术在细胞生物研究中最重要的应用是生物细胞增殖周期的定量分析。通过对细胞DNA进行特异性的荧光标记，常用的荧光染色有PI、EB、AO等，经FCM测量、获得DNA含量分布的组方图，采用DNA细胞周期分析程序、快速计算生长期分布百分比，用增殖数S+G 2 M期细胞或S期的百分比、以表示细胞群体的增殖状态和DNA的合成速度。大量的文献报道已证实DNA细胞增殖周期的分析对反映细胞群体的增殖活性具有重要意义 [4，5] 。
本实验结果显示，0.1mg/L和1mg/L浓度GS201在作用24h时就能够促进OECs增殖，这一作用可一直延续10d。第10d将样本置于相差显微镜观察上，OECs数量明显高于未用GS201的对照组。流式细胞仪测定结果显示药物浓度为0.1mg/L和1mg/L的GS201、OECs增殖活力有明显增高趋势，这说明GS201对体外培养的OECs有促进增殖作用。流式细胞仪测得结果和OECs计数所得的生长曲线相对应。浓度低的(0.01mg/L)GS201组则没有促进OECs增殖作用，在体外培养24h和72h时，流式细胞分析S期细胞的百分比与对照组相比，差异没有显著意义(P>0.05)，这一结果表明浓度过低时其促进作用不明显。
, http://www.100md.com
本研究结果表明:一定浓度的GS201，在新西兰兔嗅球鞘细胞的体外培养中可明显地促进OECs的增殖从而达到促进神经细胞损伤的修复效果[6] 。主要作用可能通过调节酪氨酸激酶、影响细胞因子产生发挥其作用。GS201作为一种海洋多糖类药物其神经细胞营养作用是通过何种途径介导有待进一步探讨。
参考文献
1 Rainer probstmeier，christin C.Chondriotin sulfates expressed on oligoˉdendrocyte-derived Tenascin-R are involved in neural cell recongniˉtion.Functional implications during CNS development and regeneration.J Neurosci Res，2000，60:21.
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3 Ramon-Cueto A，Cordeo MI，Santos-Benito FF，et al.Functional reˉcovery ofparaplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia.Neuron，2000，25:425-435.
4 Syriod D，Zorick T，Engels C，et al.A role for insulin-like growth facˉtor-1in the regulation of Schwann cell survival.J Reconstr Microsurg，1999，15:61-65.
5 Yan Q.in vivo neurotrophic effects GONF on neonatal and adult facial motorneurons.Nature，1995，373:341-344.
6 Junghans U.Purification of a meningeal cell-derived chondroitin Sulˉphateproteoglycan with neurotrophic activity fou brain neurons and its iˉdentification as giglycan.Eur J Neurosci，1995，7(11):2341.
(编辑 元红), 百拇医药(布林)