市售小柴胡颗粒的指纹图谱研究(1)
闫磊 林龙飞 张慧 党晓芳 倪健
[摘要] 该研究采用高效液相色谱法建立了市售小柴胡颗粒的指纹图谱，并对不同厂家和同一厂家不同批次小柴胡颗粒进行了指纹图谱研究，首次对其中7种主要指标性成分进行了指认，为小柴胡颗粒的质量评价提供了一种较为全面的分析手段。
[关键词] 小柴胡颗粒；高效液相色谱法；指纹图谱；质量评价
小柴胡颗粒是根据东汉张仲景《伤寒论》中的小柴胡汤方加工制成的现代中成药，是中医和解剂的代表方，由柴胡、黄芩、党参、甘草、姜半夏、大枣和生姜7味药组成，具有解表散热、疏肝和胃的功效[1]。现代药理研究表明，该方还具有较好的抗炎、保肝利胆、调节免疫、抗肿瘤等作用，在临床上应用广泛[2-3]。小柴胡颗粒生产厂家众多，质量参差不齐，仅针对某个或几个指标成分进行定性、定量分析并不能对其质量进行有效地控制，而特征指纹图谱能较全面直观地表征出中药复方制剂中所含化学成分的种类和数量，进而反映该制剂内在的质量[4]。因此本研究建立了市售小柴胡颗粒的HPLC指纹图谱研究方法，对小柴胡颗粒中7 种主要指标性成分进行同时分析测定，并用相似度评价软件和SPSS软件，对其指纹图谱的特征峰数据进行了相似度计算和系统聚类分析，评价了不同厂家和同厂家不同批次市售小柴胡颗粒的质量，旨在为小柴胡颗粒的质量评价提供一种较为全面的分析手段。
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1 材料
Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；G1311C 1260Quat四元泵(美国安捷伦)；G1329B 1260ALS进样器(美国安捷伦)；G1314B 1260VWD VL检测器(美国安捷伦)；Rev.B.04.03[52]液相色谱工作站(美国安捷伦)；BT 125D天平(赛多利斯)；KH5200E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。
本试验收集了11个不同厂家市售小柴胡颗粒，购自全国各地零售药店。样品来源和批号见表1，2。将11个厂家样品随机编号，依次记为S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9，S10，S11。
黄芩苷(baicalin，批号110715-201117)、黄芩素(baicalein，批号111595-201105)、汉黄芩素(wogonin，批号111514-201016)、甘草苷(liquiritin，批号111610-201106)、甘草酸铵(ammonium glycyrrhizinate，批号110731-201116)、柴胡皂苷A(saikosaponin A，批号110777-201108)对照品均购于中国食品药品检定研究院；汉黄芩苷(wogonoside，批号111014)对照品购于四川省维克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯(美国Fisher)，磷酸为分析纯(天津市光复科技发展有限公司)，水为娃哈哈纯净水。
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2 方法与结果
2.1 色谱条件
Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱，程序见表3，流速0.8 mL·min1；检测波长210 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。所有组分于120 min内被检测完。
2.2 混合对照品溶液的制备
分别取甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、柴胡皂苷A和汉黄芩素对照品适量精密称定，置10 mL量瓶中，用甲醇定容，制成质量浓度分别为0.015 3，0.507，0.104，0.021 5，0.050 6，0.011 8，0.011 5 g·L-1的混合对照溶液，过0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液作为混合对照品溶液，备用。
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2.3 供试品溶液的制备
取同一厂家同一批次小柴胡颗粒适量，研成细粉，取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 取S1厂家小柴胡颗粒样品1份，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别准确吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，按2.1项下条件测定，记录指纹图谱，以黄芩苷色谱峰(指纹图谱中14号峰)为内参比峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，结果表明所有共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。
2.4.2 稳定性试验 取S1厂家小柴胡颗粒样品1份，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别在0，3，12，24，48 h，按2.1项下条件进样测定，记录指纹图谱，以黄芩苷色谱峰(指纹图谱中14号峰)为内参比峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明所有共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明样品在48 h内稳定。
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2.4.3 重复性试验 取S1厂家小柴胡颗粒样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，各吸取10 μL，按2.1项下条件测定，记录指纹图谱，以黄芩苷色谱峰(指纹图谱中14号峰)为内参比峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明所有共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明重复性良好。
2.5 小柴胡颗粒指纹图谱的测定及技术参数
2.5.1 不同厂家小柴胡颗粒的指纹图谱测定及共有峰标定 取上述11个厂家小柴胡颗粒样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别准确吸取混合对照品溶液及11个小柴胡颗粒样品的供试品溶液各10 μL，按2.1项下条件测定，记录指纹图谱。, 百拇医药
[摘要] 该研究采用高效液相色谱法建立了市售小柴胡颗粒的指纹图谱，并对不同厂家和同一厂家不同批次小柴胡颗粒进行了指纹图谱研究，首次对其中7种主要指标性成分进行了指认，为小柴胡颗粒的质量评价提供了一种较为全面的分析手段。
[关键词] 小柴胡颗粒；高效液相色谱法；指纹图谱；质量评价
小柴胡颗粒是根据东汉张仲景《伤寒论》中的小柴胡汤方加工制成的现代中成药，是中医和解剂的代表方，由柴胡、黄芩、党参、甘草、姜半夏、大枣和生姜7味药组成，具有解表散热、疏肝和胃的功效[1]。现代药理研究表明，该方还具有较好的抗炎、保肝利胆、调节免疫、抗肿瘤等作用，在临床上应用广泛[2-3]。小柴胡颗粒生产厂家众多，质量参差不齐，仅针对某个或几个指标成分进行定性、定量分析并不能对其质量进行有效地控制，而特征指纹图谱能较全面直观地表征出中药复方制剂中所含化学成分的种类和数量，进而反映该制剂内在的质量[4]。因此本研究建立了市售小柴胡颗粒的HPLC指纹图谱研究方法，对小柴胡颗粒中7 种主要指标性成分进行同时分析测定，并用相似度评价软件和SPSS软件，对其指纹图谱的特征峰数据进行了相似度计算和系统聚类分析，评价了不同厂家和同厂家不同批次市售小柴胡颗粒的质量，旨在为小柴胡颗粒的质量评价提供一种较为全面的分析手段。
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1 材料
Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；G1311C 1260Quat四元泵(美国安捷伦)；G1329B 1260ALS进样器(美国安捷伦)；G1314B 1260VWD VL检测器(美国安捷伦)；Rev.B.04.03[52]液相色谱工作站(美国安捷伦)；BT 125D天平(赛多利斯)；KH5200E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。
本试验收集了11个不同厂家市售小柴胡颗粒，购自全国各地零售药店。样品来源和批号见表1，2。将11个厂家样品随机编号，依次记为S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9，S10，S11。
黄芩苷(baicalin，批号110715-201117)、黄芩素(baicalein，批号111595-201105)、汉黄芩素(wogonin，批号111514-201016)、甘草苷(liquiritin，批号111610-201106)、甘草酸铵(ammonium glycyrrhizinate，批号110731-201116)、柴胡皂苷A(saikosaponin A，批号110777-201108)对照品均购于中国食品药品检定研究院；汉黄芩苷(wogonoside，批号111014)对照品购于四川省维克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯(美国Fisher)，磷酸为分析纯(天津市光复科技发展有限公司)，水为娃哈哈纯净水。
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2 方法与结果
2.1 色谱条件
Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱，程序见表3，流速0.8 mL·min1；检测波长210 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。所有组分于120 min内被检测完。
2.2 混合对照品溶液的制备
分别取甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、柴胡皂苷A和汉黄芩素对照品适量精密称定，置10 mL量瓶中，用甲醇定容，制成质量浓度分别为0.015 3，0.507，0.104，0.021 5，0.050 6，0.011 8，0.011 5 g·L-1的混合对照溶液，过0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液作为混合对照品溶液，备用。
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2.3 供试品溶液的制备
取同一厂家同一批次小柴胡颗粒适量，研成细粉，取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 取S1厂家小柴胡颗粒样品1份，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别准确吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，按2.1项下条件测定，记录指纹图谱，以黄芩苷色谱峰(指纹图谱中14号峰)为内参比峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，结果表明所有共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。
2.4.2 稳定性试验 取S1厂家小柴胡颗粒样品1份，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别在0，3，12，24，48 h，按2.1项下条件进样测定，记录指纹图谱，以黄芩苷色谱峰(指纹图谱中14号峰)为内参比峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明所有共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明样品在48 h内稳定。
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2.4.3 重复性试验 取S1厂家小柴胡颗粒样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，各吸取10 μL，按2.1项下条件测定，记录指纹图谱，以黄芩苷色谱峰(指纹图谱中14号峰)为内参比峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明所有共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明重复性良好。
2.5 小柴胡颗粒指纹图谱的测定及技术参数
2.5.1 不同厂家小柴胡颗粒的指纹图谱测定及共有峰标定 取上述11个厂家小柴胡颗粒样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别准确吸取混合对照品溶液及11个小柴胡颗粒样品的供试品溶液各10 μL，按2.1项下条件测定，记录指纹图谱。, 百拇医药