大鼠骨髓间充质干细胞与成纤维细胞差异蛋白质组学研究(1)
[摘要]目的：进行大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)与成纤维细胞(FBs)细胞的蛋白质组学研究，寻找出重要的差异蛋白质。方法：采用二维电泳的方法(2DE)分别分离两种细胞的蛋白质，用PDQuest软件分析蛋白表达差异，并采用质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定。结果：发现了MSCs和FBs之间存在差异表达的15种蛋白质，其中4种蛋白质差异显著且与细胞功能密切相关，即SM22-α、鸟嘌呤脱氨基酶(Guanine deaminase，GD)、膜联蛋白(Annexin A5)、过氧化物岐化酶-2(superoxide dismutase 2，SOD-2)。MSCs 的SM22-α和Annexin A5的表达分别比FBs低26倍和8倍，而MSCs的GD和SOD-2表达分别比FBs高16倍和21倍。结论：与大鼠FBs相比，MSCs存在更多防止细胞损伤相关的蛋白质和更少的与细胞衰老过程密切相关的蛋白质，具有高分化潜能，更适合于作为组织工程种子细胞。
[关键词]骨髓间充质干细胞；成纤维细胞；蛋白质组学
, http://www.100md.com
[中图分类号]Q831[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2008)07-1021-05
Comparative proteomic analysis of mouse mesenchymal stem cells and skin-derived fibroblasts
SUN Yang1,ZHAO Liang2,WEI Xu-feng2,YI Wei2,GUO Shu-zhong1
(Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi,China)
Abstract:ObjectiveTo analysis and to compare the proteomic differences between mesenchymal stem cells(MSCs) and fibroblasts(FBs), and to discover the key different proteins.MethodsSeparate the protein of cells by 2 dimension electrophoresis(2DE), analysis the differences of protein expression with PDQues, and identify with MALDI-TOF-MS. ResultsDiscover fifteen different types of proteins, four of which associate with different functions of MSCs and FBs. Those are SM22-alpha, Guanine deaminase(GD), Annexin A5 and superoxide dismutase 2 (SOD-2). the expression of SM22-αand Annexin A5 in MSCs is separately 26 folds and 8 folds lower than in FBs, but MSCs express GD and SOD2 16 folds and 21 folds higher than FBs.ConclusionCompared with FBs, MSCs express more kinds of proteins that can prevent the damage of themselves, while have fewer proteins associated with aging in expression. Plus pluripotent differentiation potential, they are better seed cells for tissue engineer.
, 百拇医药
Key words: mesenchymal stem cells; fibroblasts; proteome
骨髓间充质干细胞(MSCs)与成纤维细胞(FBs)都可作为组织工程种子细胞，两者都具备分泌细胞外基质的能力，且MSCs可在一定条件下诱导分化为FBs。然而，MSCs具备生长和分化的能力，FBs却不具备分化潜能。本研究从蛋白质组水平比较MSCs与FBs蛋白表达的差异，试图找到使MSCs具备分化潜能的关键蛋白质，深入了解导致MSCs与 FBs不同功能的结构基础，为进一步深入研究和改建 MSCs成为具有完全功能的组织工程种子细胞打下基础。
1材料和方法
1.1 试剂、仪器及动物
1.1.1 试剂： DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；双抗(青霉素、链霉素)、EDTA钠、肝素钠、Percol1分离液均购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自四季青公司；CD34，CD29，CD45和FITC标记的二抗均购自美国SantaCruz公司；溶液均由Milli-Q水配制而成；其它试剂均为分析纯。
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1.1.2 仪器：二维电泳系统及PDQuest凝胶分析软件购自美国Bio-Rad公司；Powerlook 2100XL凝胶图像扫描仪购自美国UMAX公司；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)购自德国。
1.1.3 动物：SD大鼠子鼠，雄性，年龄 16～17天，购自第四军医大学实验动物中心。
1.2 方法
1.2.1 大鼠MSCs的分离与培养：选用雄性SD大鼠子鼠，用体积分数为3.5%的水合氯醛腹腔注射麻醉。分离出四肢骨，用DMEM培养基冲洗骨髓腔。将冲洗获得的溶液以300g/min的速度离心5min。弃上清液，再用培养基重悬沉淀，加入到梯度Percoll液中，以900g/min的速度离心20min。吸取交界面处云雾状层，用含质量分数为10%FBS的DMEM培养基重新悬浮，以300g/min的速度离心5min，弃上清液，置于培养瓶内接种，培养。24～48h后更换培养液，弃去未贴壁细胞。5～6天消化分瓶传代培养。
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1.2.2 大鼠FBs的分离与培养：处死大鼠，用75%酒精浸泡3～5min，切取2cm×3cm大小背部皮肤2块，用PBS缓冲液清洗2～3次。然后将其切成长约1cm宽0.3～0.5cm左右的皮条。用浓度为2.4U/mlDSP酶在37℃消化1～1.5h左右，撕去表皮层，将真皮层剪成约1mm3的碎块，移入5ml胶原酶，在37℃培养箱中消化1～1.5h，每20min左右振荡，消化到组织块散开为止。加培养液稀释胶原酶，用吸管吹打，再用100目的钢网过滤，祛除剩余的组织块。收集细胞悬液，以300g/min的速度离心9min，细胞记数，以2×105/ml的细胞量接种，置于培养箱中培养。
1.2.3 MSCs表面抗原的鉴定：用2.5g/L 胰蛋白酶消化后收获第3代细胞，其分别与抗CD29，CD34，CD45的单克隆抗体饱和溶液在室温下反应30min，然后用PBS洗涤2次，再与FITC标记的二抗避光作用15min。最后用PBS洗涤并重悬于PBS中，对MSCs表面抗原进行流式分析。, http://www.100md.com(孙 阳 赵 亮 魏旭峰 易 蔚 郭树忠)
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[中图分类号]Q831[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2008)07-1021-05
Comparative proteomic analysis of mouse mesenchymal stem cells and skin-derived fibroblasts
SUN Yang1,ZHAO Liang2,WEI Xu-feng2,YI Wei2,GUO Shu-zhong1
(Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi,China)
Abstract:ObjectiveTo analysis and to compare the proteomic differences between mesenchymal stem cells(MSCs) and fibroblasts(FBs), and to discover the key different proteins.MethodsSeparate the protein of cells by 2 dimension electrophoresis(2DE), analysis the differences of protein expression with PDQues, and identify with MALDI-TOF-MS. ResultsDiscover fifteen different types of proteins, four of which associate with different functions of MSCs and FBs. Those are SM22-alpha, Guanine deaminase(GD), Annexin A5 and superoxide dismutase 2 (SOD-2). the expression of SM22-αand Annexin A5 in MSCs is separately 26 folds and 8 folds lower than in FBs, but MSCs express GD and SOD2 16 folds and 21 folds higher than FBs.ConclusionCompared with FBs, MSCs express more kinds of proteins that can prevent the damage of themselves, while have fewer proteins associated with aging in expression. Plus pluripotent differentiation potential, they are better seed cells for tissue engineer.
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骨髓间充质干细胞(MSCs)与成纤维细胞(FBs)都可作为组织工程种子细胞，两者都具备分泌细胞外基质的能力，且MSCs可在一定条件下诱导分化为FBs。然而，MSCs具备生长和分化的能力，FBs却不具备分化潜能。本研究从蛋白质组水平比较MSCs与FBs蛋白表达的差异，试图找到使MSCs具备分化潜能的关键蛋白质，深入了解导致MSCs与 FBs不同功能的结构基础，为进一步深入研究和改建 MSCs成为具有完全功能的组织工程种子细胞打下基础。
1材料和方法
1.1 试剂、仪器及动物
1.1.1 试剂： DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；双抗(青霉素、链霉素)、EDTA钠、肝素钠、Percol1分离液均购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自四季青公司；CD34，CD29，CD45和FITC标记的二抗均购自美国SantaCruz公司；溶液均由Milli-Q水配制而成；其它试剂均为分析纯。
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1.1.2 仪器：二维电泳系统及PDQuest凝胶分析软件购自美国Bio-Rad公司；Powerlook 2100XL凝胶图像扫描仪购自美国UMAX公司；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)购自德国。
1.1.3 动物：SD大鼠子鼠，雄性，年龄 16～17天，购自第四军医大学实验动物中心。
1.2 方法
1.2.1 大鼠MSCs的分离与培养：选用雄性SD大鼠子鼠，用体积分数为3.5%的水合氯醛腹腔注射麻醉。分离出四肢骨，用DMEM培养基冲洗骨髓腔。将冲洗获得的溶液以300g/min的速度离心5min。弃上清液，再用培养基重悬沉淀，加入到梯度Percoll液中，以900g/min的速度离心20min。吸取交界面处云雾状层，用含质量分数为10%FBS的DMEM培养基重新悬浮，以300g/min的速度离心5min，弃上清液，置于培养瓶内接种，培养。24～48h后更换培养液，弃去未贴壁细胞。5～6天消化分瓶传代培养。
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1.2.2 大鼠FBs的分离与培养：处死大鼠，用75%酒精浸泡3～5min，切取2cm×3cm大小背部皮肤2块，用PBS缓冲液清洗2～3次。然后将其切成长约1cm宽0.3～0.5cm左右的皮条。用浓度为2.4U/mlDSP酶在37℃消化1～1.5h左右，撕去表皮层，将真皮层剪成约1mm3的碎块，移入5ml胶原酶，在37℃培养箱中消化1～1.5h，每20min左右振荡，消化到组织块散开为止。加培养液稀释胶原酶，用吸管吹打，再用100目的钢网过滤，祛除剩余的组织块。收集细胞悬液，以300g/min的速度离心9min，细胞记数，以2×105/ml的细胞量接种，置于培养箱中培养。
1.2.3 MSCs表面抗原的鉴定：用2.5g/L 胰蛋白酶消化后收获第3代细胞，其分别与抗CD29，CD34，CD45的单克隆抗体饱和溶液在室温下反应30min，然后用PBS洗涤2次，再与FITC标记的二抗避光作用15min。最后用PBS洗涤并重悬于PBS中，对MSCs表面抗原进行流式分析。, http://www.100md.com(孙 阳 赵 亮 魏旭峰 易 蔚 郭树忠)