1.1.2 软骨细胞培养:在无菌环境下取SD大鼠两侧肋软骨,剪碎成1 mm3组织块,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次,0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA 37℃振荡消化30min,PBS冲洗2次,再以0.2%Ⅱ型胶原酶(美国Oncogene公司) 37℃振荡消化6～8h,过滤、离心、收集、计数,以2.5×104个/cm2的细胞密度接种于培养皿,体外常规培养与扩增,第2代细胞用于实验。

    1.2 BMSC向软骨细胞的诱导培养:从软骨细胞P1开始,收集软骨细胞上清液,0.22μm滤网抽滤消毒,4℃保存备用。当P1 BMSC达到80%融合时,消化收集细胞,以1.5×104个/cm2细胞密度接种于培养皿中,其中预置载玻片,加入含10%胎牛血清的DMEM培养过夜。待细胞贴壁后,吸除培养液,加入软骨细胞上清液进行诱导培养,为诱导组。直接用全培养液培养的BMSC为未诱导组。每天半量换液,诱导7天后取出玻片,用95%冷丙酮固定玻片,进行免疫组化检测。收集培养皿内的剩余细胞进行RT-PCR鉴定。

    1.3 细胞接种与体内移植:取第2代BMSCs与软骨细胞以7: 3(BMSCs: 软骨细胞)比例混合均匀后以5.0×107个/ml的终浓度接种于壳聚糖生物材料(直径9mm,高3mm)上。相同终浓度 (5.0×107个/ml) 的单纯软骨细胞和单纯BMSCs分别作为阳性对照组和阴性对照组 ......