人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定(1)
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[摘要]目的：研究人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定方法。方法：采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，用EGM-2培养基在多聚赖氨酸包被的培养板中进行诱导培养，动态地观察贴壁细胞的生长状况，免疫组织化学技术检测培养细胞表面标志物的表达。结果：人外周血单个核细胞经体外培养至第2天，呈贴壁生长，细胞形态为大小相近的圆球体；第4天一些细胞开始出现尾状物，形态呈蝌蚪样改变，部分细胞聚集形成细胞簇；至第7天细胞形态变长，呈梭形改变，细胞间相互围绕呈环形，并有集落出现，免疫组织化学染色CD133、CD34、VEGFR-2和Ⅷ因子表达均呈阳性。结论：运用本实验方法可以成功实现人外周血内皮祖细胞的分离、培养和扩增。
[关键词]内皮祖细胞；外周血；细胞培养
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2012)08-1318-03
内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells， EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，亦称血管母细胞(angioblast)，EPCs不仅参与胚胎血管生成，而且也参与出生后的血管新生过程。近些年来人们对EPCs在血管形成、心脑血管疾病和创伤愈合等方面的作用进行了广泛的研究[1]，EPCs移植技术已成为治疗心脑血管疾病的一种新兴的方法[2]，具有广阔的临床应用前景。但由于EPCs的来源有限，目前的培养方法尚不能满足基础研究和临床治疗的需要，在本实验中，笔者研究从来源相对广泛的人外周血中分离培养EPCs，为EPCs的应用提供一种便捷有效的分离方法。
1 材料和方法
1.1 材料：主要试剂和仪器：内皮细胞培养基(Endothelial Cell Growth Medium-2，EGM-2)(Lonza公司)。人淋巴细胞分离液(天津灝洋生物制品有限公司)。鼠抗人CD133单克隆抗体、血管内皮生长因子受体2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR-2)(北京博奥森生物技术有限公司)。鼠抗人CD34单克隆抗体、Ⅷ因子、鼠兔通用型二抗、浓缩型二氨基联苯胺(Diaminobenzidine， DAB)试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。多聚赖氨酸、多聚甲醛(Sigama公司)。Olympus倒置显微镜(日本)。
1.2 方法
1.2.1 人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)的分离：采集健康人外周血30ml，肝素抗凝后用(Phosphate Buffer Saline，PBS)稀释(1：1)，稀释液沿试管壁缓慢加入到人淋巴细胞分离液(Ficoll)液面上(血液与Ficoll体积比为2：3)，然后将其放到水平离心机内以2000r/min速度离心20min。离心后液体从上到下被分为四层，依次为血浆层，单个核细胞层，淋巴细胞分离液层，红细胞层。吸取单个核细胞层后加入等体积含有2%胎牛血清的PBS，以1 000r/min速度离心10min，弃上清液，离心两遍，清洗两遍。
1.2.2 细胞的培养和扩增：将分离出的细胞以10×106个细胞/孔接种于经多聚懒氨酸包被的六孔板中，在温度为37℃、二氧化碳体积分数为5%、湿度≥95%的条件下，用EGM-2培养基(含胎牛血清、VEGF、青霉素和链霉素)培养，隔天换液，换液后用倒置显微镜观查细胞的生长状况，并照相。
1.2.3 细胞表面标志物的检测：细胞培养至第7天后用洗掉非贴壁细胞，留下的贴壁细胞用胰酶消化，消化完成后加完全培养基终止，吸取细胞液以1 000r/min速度离心10min。将离心后的细胞加培养基混匀，然后滴加到培养皿内的细胞贴片上，让细胞贴片30min后，在培养皿内轻轻的添加完全培养液，放于温度为37℃、二氧化碳体积分数为5%、湿度≥95%培养箱中培养至细胞爬满爬片。运用二部法免疫组化检测细胞表面标志CD133、CD34、血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)和Ⅷ因子的表达，并设阴性对照组加以对比。
2 结果
3 讨论
内皮祖细胞不仅参与胚胎组织血管化和出生后的血管生成，还参与机体器官损伤后的血管再生与修复，在缺血性疾病、预防血管再狭窄、血管创伤愈合等过程中具有重要的治疗作用[3]。1997年，Asahara等[4]首先发现在循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞，并将其命名为血管内皮祖细胞(EPCs)，此后，人们发现骨髓和脐血中也存在EPCs，而且含量远多于外周血。尽管如此，由于人外周血较骨髓和脐血取材相对便利且用量易于控制，使外周血分离培养EPCs成为EPCs应用研究中的可靠获取途径。
生理状态下，成人EPCs主要存在于骨髓内，外周血中含量低，传统采用包被抗CD34、VEGFR2或CD133抗体的免疫磁珠分选法进行筛选、分离EPCs。由于EPCs特异性表面标志物缺乏，因此通过抗体的免疫磁珠筛选出的EPCs纯度高，但数量少[5]。此外，免疫磁珠分选法的技术难度大、价格也比较昂贵。为增加实验用EPCs的数量，本实验利用密度梯度离心法将外周血液中的EPCs进行富集 ......
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