Ficoll密度梯度离心法分离腹水单个核细胞方法的优化
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【摘要】 目的：使用Ficoll密度梯度离心法分离腹水单个核细胞，并对方法进行优化，以提高腹水单个核细胞分离的纯度。方法：收集腹水标本12份，每份标本离心富集细胞后均分为2份，分为常规组和优化组。常规组使用Ficoll分离液直接分离单个核细胞；优化组先将腹水用PBS缓冲液洗涤一次，再与Ficoll分离液进行两次分离。分离后用PBS缓冲液稀释到相同体积，使用计数盘计算细胞浓度，使用台盼蓝染色法计算活率以及使用瑞氏-姬姆萨复合染色法计算细胞纯度。结果：常规组细胞浓度低于优化组，差异有统计学意义(t=-2.268，P=0.044)；两组活率差异无统计学意义(t=1.856，P=0.090)；常规组纯度低于优化组，差异有统计学意义(t=-6.416，P=0.000)。结论：使用PBS洗涤一次后，再进行两次分离，可提高单个核细胞的数量和纯度，而活率不受影响。
【关键词】 Ficoll密度梯度离心法； 单个核细胞； 腹水
中图分类号 R446 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2013)20-0144-02
可以引起腹水的疾病有很多，常见有肿瘤、炎症、结核等。一般情况下，腹水的实验室检查通常只包括理学检查、细胞学检查及生化检查。随着免疫学、细胞生物学、分子生物学在疾病诊断治疗领域的应用，可能需要对腹水中的细胞组份进行检查，这就要求对腹水中的细胞组份进行分以获取足够数量、活率高和纯度高的单个核细胞(MNC)。Ficoll密度梯度离心法是分离单个核细胞的常用方法，但由于腹水的成份复杂，常规方法的分离效果较差，难以获得高纯度的单个核细胞。因此，笔者尝试优化分离方法，以期获取高纯度的腹水单个核细胞。
1 材料与方法
1.1 材料
腹水标本均来自本院2012年8-10月的住院患者，抽取腹水的量>20 ml，肝素抗凝后送检。选取白细胞大于100×106/L的标本共12份，其中癌性胸腹水5份，结核性胸水3份，其他原因(肝硬化等)胸腹水4例。以1000 r/min离心10 min，视白细胞浓度弃去部分上清液，目的是富集细胞。混匀后，将标本平均分成2份，一份用于常规实验组实验，一份用于优化实验组实验。
1.2 试剂
淋巴细胞分离液密度为(1.077±0.02)g/ml(提供者：上海沪试)，台盼兰粉剂(International Laboratory USA)用双蒸水溶解为4%(4 g/100 ml)的母液 ......
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